Il sessaggio molecolare spiegato “in breve”
Il sessaggio molecolare consente di determinare il genere (maschio o femmina) di un soggetto attraverso l’analisi di una porzione del suo DNA. (Scopri come richiedere l’analisi)
Questa tipologia di test è particolarmente utile in campo ornitologico in quanto permette di pianificare accuratamente e precocemente gli accoppiamenti, l’assortimento delle coppie, la vendita e lo scambio di soggetti. È efficace anche in quelle specie che non presentano differenze morfologiche o di comportamento fino ad una determinata età o addirittura per tutta la vita. Inoltre l’osservazione del comportamento può essere falsata da diversi fattori come: comportamenti anomali, cicli di luce che non garantiscono il raggiungimento dei corretti livelli ormonali o poco tempo a disposizione per l’osservazione dei soggetti.
Ma come si esegue il sessaggio molecolare?
Fase 1: Ricevimento e valutazione del campione
Un buon campione è fondamentale per la riuscita del test del sessaggio molecolare. Prima di sottoporre il campione ad analisi i nostri tecnici di laboratorio eseguono una valutazione visiva preliminare del campione per valutarne l’idoneità. Campioni con calamo assente o di dimensioni ridotte (inferiore a 3 mm) o un’eccessiva presenza di sangue così come la presenza di materiale organico o inorganico, possibile fonte di inibitori, rendono quasi impossibile la riuscita dell’analisi. In questi casi viene quindi richiesto immediatamente al cliente l’invio di una nuova campionatura.
Nel caso ottimale in cui il campione rispetti gli standard previsti viene ad esso assegnato un identificativo univoco di laboratorio che lo contrassegnerà e lo accompagnerà per tutto il corso dell’analisi.
Fase 2: Preparazione del campione ed estrazione del DNA
Per poter essere analizzato, un campione deve essere prima preparato. Il calamo della penna viene tagliato in piccoli pezzi ed immerso in una soluzione liquida, chiamata mix di estrazione del DNA, all’interno di una provetta. Tra un campione e l’altro gli strumenti di laboratorio vengono accuratamente sterilizzati con alcol etilico e passaggio sulla fiamma per evitare contaminazioni.
A questo punto, le provette contenenti i calami e la mix di estrazione vengono inserite in uno strumento che, attraverso un movimento centrifugo, consente di separare il DNA da altre componenti presenti.
Fase 3: Amplificazione del DNA
Il processo di estrazione consente di ottenere una piccola quantità del frammento di DNA target. Per proseguire con l’analisi è quindi necessario procedere con l’amplificazione del materiale genetico, una tecnica che consente di riprodurre in un numero esponenziale di copie il tratto del DNA contenente le informazioni sul sesso del soggetto: una parte della mix di estrazione viene inserita all’interno di provette contenenti una differente soluzione liquida, chiamata mix di reazione. Le provette vengono successivamente collocate all’interno di un apposito strumento e sottoposte a cicli di temperatura variabile. Al termine dell’amplificazione, la quantità di DNA ottenuta risulta sufficiente per poter proseguire con l’analisi.
Fase 4: Visualizzazione e interpretazione dei risultati
Una volta ottenuta la quantità di DNA necessaria ai fini dell’analisi si procede con la “lettura” dell’informazione in essa contenuta. Per farlo è necessario ottenere dei dati interpretabili visivamente. Questo avviene, a seconda della specie di appartenenza del soggetto, caricando il contenuto delle provette su un gel di agarosio o al sequenziatore , restituendo un dato simile a quello riportato nelle figure sottostanti:
Fig.1 I frammenti di DNA caricati su un gel elettroforetico si separano a seconda delle loro dimensioni, identificate empiricamente tramite un marcatore di peso molecolare caricato nel primo e nell’ultimo pozzetto. I campioni che presentano la sola banda alta (500 bp) saranno identificati come maschi, mentre i campioni che presentano la banda alta e quella bassa (rispettivamente 500 e 300 bp) o la sola banda bassa (300 bp) saranno identificati come femmine.
Fig.2 Il sequenziatore effettua un’elettroforesi di tipo capillare. Al termine di una corsa, i risultati vengono visualizzati tramite software informatico. I campioni presentano picchi di dimensioni specie specifiche: generalmente la presenza di un solo picco individua un soggetto di sesso maschile, mentre la presenza di due picchi è da attribuire ad un soggetto di sesso femminile.
I dati ottenuti vengono quindi interpretati consentendo così di determinare il sesso del soggetto analizzato.
Inoltre…
Analizzare DNA di buona qualità è fondamentale per ottenere il risultato. Non tutte le penne consentono di avere la stessa quantità di DNA o contengono DNA di buona qualità. Per questo in alcuni casi è necessario ripetere l’analisi più volte.
Inoltre il materiale e le strumentazioni utilizzate nella fase di estrazione, amplificazione e visualizzazione dei risultati possono variare a seconda della specie del soggetto. Per evitare di incorrere in errori di interpretazione è importante indicare nell’ordine la specie corretta.
